1、分离机制
RPLC根据吸附机制分离多肽，其分离原理主要是根据分子流经柱子时在固定相和流动相之间分配的平衡机制，多肽因分子太大而不能进入疏水固定相的内部，吸附在疏水表面，随着流动相浓度逐渐增大而逐渐被解吸。多肽进入色谱柱后，吸附在吸附剂表面，只有当溶剂大大一个特定的浓度才会被解吸，一旦解吸，他们向后流经色谱柱时仅与吸附剂表面存在微弱的相互作用。
2、 RPLC基于“疏水脚”的细微差异分离多肽分子
“疏水脚”的差异源于氨基酸序列和构象的差异，解吸发生在一个非常窄的有机试剂浓度范围内，这样多肽在解吸前可以较为完全的实现吸附保持，知道有机试剂浓度达到某个关键浓度后迅速被解吸。因为多肽对有机改性试剂的准确浓度高度敏感，因此RPLC对多肽的分离具有较高的选择性，才会有我们通常所看到的尖锐的分离峰。在有机改性剂的浓度发生变化时，小肽比小分子更容易解吸，但比蛋白质的解吸要慢，这说明了分离机制的非单一性。
3、RPLC色谱柱的特点及组成
RPLC色谱柱提供疏水性表面使多肽吸附，柱子是由不锈钢管组成，内部装满直径细小的球形吸附颗粒，通常为二氧化硅，表明经硅烷修饰后使之呈现疏水性，此外，合成的球形多聚物如聚苯乙烯-二乙烯苯等也可作为RPLC的吸附剂使用。下表为一些常见的RPLC填料：
图1 RPLC固定相类型
3.1、固定相类型
RPLC吸附剂是利用氯硅烷在二氧化硅介质上结合烃基，即利用氯为反应基团使烃基与硅基的分子结合。烃基疏水基团通常是18（C18）、8（C8）或4（C4）个碳原子的脂肪族烃。尽管有些指南指出某种基团分离某些给定大小和疏水性的多肽效果更好，但实际上不同长度的听立案对蛋白质分离效果差别较小，如下图2所示，C18柱子通常用于多肽或分子质量小于5000 Da的蛋白质或其他溶质分子。最小和最亲水的多肽最好用小孔的C18柱，因为它比大孔吸附剂的表面积大。相反，大于5000 Da的特别具有疏水性的蛋白质或肽，用C4柱最好。C8柱在应用上与C18相似，但有时它们对某些特殊多肽的选择性和分离能力不同。
图2 疏水相的选择
反相表面的多样性会影响多肽的分离，其影响虽小，但很重要，可通过选择利用不同的烷烃来优化多肽的分离。
3.2 吸附剂孔径
RPLC吸附剂一般以硅胶为介质，是一种多孔材料，大部分的相互作用界面位于孔内，多肽需要进入孔内才能被吸附和分离。RPLC一般利用孔径大约为100 A(o)的颗粒进行分离（分子量小于2000 Da），但大部分多肽和蛋白质在这些材料上的表现比较差，因而大多数多肽、蛋白质等分子使用300 A(o)的颗粒进行分离。有时候直径非常小的（1-2μm）的五孔颗粒会被用于蛋白质分离，但这种柱子的样品容量非常小，而且柱压较高，他们适合于一些快速分析场合，因而较少用于蛋白纯化。
3.3 吸附剂颗粒大小
吸附剂颗粒大小直接影响洗脱峰的宽窄，直径小的颗粒产生的色谱峰较为尖锐，分辨率较高，因而建议在分析型和半制备色谱分离中使用直径5 μm以下的颗粒，而在直径较大的色谱柱（d>10mm）中使用较大颗粒的吸附剂，不仅价格较为廉价，且反压较低，适合于制备分离。
图3 填料颗粒大小对色谱峰形的影响
3.4 常规流动相洗脱条件
对于常规C18，因其填料限制，为最大可能延长色谱柱寿命，建议长时间使用时，有机溶剂（甲醇或乙腈）使用浓度不低于10%，短时间使用极限浓度不低于5%（对于少数可耐100%水色谱柱则可直接用于100%水相洗脱，但建议使用梯度）。常规C18流动相pH为2-8（对于部分杂化色谱柱可达到1-11，一定要根据色谱柱说明书）；常规C18耐受温度为4-45℃，部分可以达到60℃甚至更高；对色谱柱进行清洗和封存时，应使用不少于10倍柱体积的流动相进行洗脱（4.6*150 mm 柱体积约为2.5 mL）。色谱柱保存溶剂推荐使用甲醇（考虑使用乙腈对仪器管路进行分析后的密封时长期浸泡单向阀可能使阀座与单向阀二者之间发生黏连）。
以上内容摘自《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》，并在此基础上进行部分修改。致敬经典！（色谱博士在《谱中人》→《致敬经典》中向VIP客户提供全书免费下载）
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