二维液相色谱/多维液相色谱 介绍

随着样品复杂性的增大，以及对复杂样品不断增长的分析需求，传统的单维液相色谱常难以满足分离要求。实际应用中，大家也能感受到SEC、RPLC、HILIC等单维液相色谱在进行样品分离时得到的色谱峰较少，尤其在定量分析时常会面临杂峰的干扰，尽管随着当下DAD/PDA等检测器的快速发展能够起到一定的区分作用，然而却无法满足对目标物质的高效分离和定量分析的需求。同时，在进行蛋白组学、肽组学等大型复杂分析时，单维液相色谱因为其分离方式/机制单一，往往难以满足分析要求，为此科研学者尝试将多种分离机制不同的液相色谱进行联接，将其用于复杂样品的分析，这一尝试取得了巨大成功，由此引发了二维、多维液相色谱（指二维以上，如三维、四维等）的快速发展，以下简单介绍二维、多维液相色谱的发展及其实施方式。

一、二维液相色谱的主要发展过程

最早出现的二维液相色谱其实是离线二维液相色谱，即将样品在经历一次液相色谱分离后，手动将流出组分一个一个收集，再进行浓缩或冻干等操作，最后再进行二次进样，采用另一种色谱模式进行分析，这种二维液相色谱的分辨率非常高，且两个维度之间的相互干扰最低，是目前所有二维色谱模式中应用最为广泛的，至今这种方式仍占据二维色谱分析中半壁以上江山。但这种色谱模式由于存在离线操作，导致其定量分析能力基本缺失，而且离线操作过程繁琐复杂，非常消耗时间，对科研人员造成了极大的负担。

为了解决这一问题，科学家们发明了在线二维液相色谱。早期由于阀切换技术不是很普及，科研学者在进行两个维度液相色谱的联接时，主要采用直接将两根液相色谱柱串联分析的方式（图1-A）或将两种色谱分段装填在同一根色谱柱中的方式以实现两个维度色谱的连接（图1-B）。这种二维色谱模式在早期硬件条件较差的条件下取得了较好的应用效果，但是该色谱模式具有严重的缺陷:两个维度尽管在分离机制上存在差异，但是两个维度的流动相完全相同，两个维度液相色谱的洗脱过程严重受到彼此的限制，因此其应用受到严重限制。

图1 直接转移式二维液相色谱，A, 左，直接转移式二维液相色谱；B, MUDPIT系统（多维蛋白分析系统）。

      为了解决这一问题，科研学者们再次对其进行改造和升级，得益于先进的阀切换技术及UPLC超高压液相色谱系统的发展，目前发展了一系列二维液相色谱。其代表作品有环切换型在线二维液相色谱及停流型二维液相色谱（注意实际上停流型二维液相色谱实际上亦属于在线二维液相色谱，为区分以上二者，遵从国际SCI写作趋势，将其单列）。

图2 环切换型二维液相色谱（上）及停流型二维液相色谱（下）

      在上述新型二维液相色谱中，两个维度的液相色谱分离基本实现完全独立，每个维度的液相色谱分离都可以使用属于自己的流动相，然而这两种液相色谱具有各自的优点和缺点。

二、二维液相色谱的特点

当前二维液相的主要代表作品如前所述，主要分为三种：离线型二维液相色谱、环切换型二维液相色谱及停流型二维液相色谱。其中离线型二维液相色谱广泛为科研学者所使用，在此不做更多描述，此处重点件数环切换型二维液相色谱及停流型二维液相色谱的特点。

环切换型在线二维液相色谱，这种二维液相色谱通常在第一维使用NanoLC、UPLC、UHPLC等液相色谱，需值得注意的是这种色谱模式其第二维液相色谱必须为UPLC，因为其阀切换过程中，组分与组分之间的转移是连续的，这一个组分分析完后马上就是下一个组分，所以这个组分的分析必须在下一个组分到来之前完成，而组分的转移时间其实是受到第一维液相色谱分析的限制的，也就是说起第二维液相色谱完全受限于第一维液相色谱分析的限制，因此第二维液相色谱的分析必须足够快（通常30s内完成一个组分的分析）。为了实现这一目标，不仅对第二维UPLC设备的耐压要求较高，且对其死体积、温度、进样量等均具有较为严格的限制，此外，通常进行快速分析时，其第二维色谱柱常为小颗粒短柱（通常长度不超过50mm）。得益于这种小颗粒色谱柱技术和UPLC设备的发展，这种二维液相色谱的优点即为分析速度快、分离能力较高。为了减小第二维液相色谱受限于第一维液相色谱的限制，目前发展了多种二维液相色谱技术，包括分流、补集柱等技术，其中最为广泛使用的是分流技术，因其不仅能延长第二维色谱分析时间，还能减小进样体积，有助于改善分离效果，但这种方式应用不当会造成信号显著降低。补集柱技术即在原有基础上使用补集柱替换两个LooP环，这种分析方式具有一定的特异性，且存在丢峰的可能性，为此其通用性受到限制。这种二维液相色谱模式目前几个进口色谱分析公司均有商业话仪器售卖，且这类公司通常拒绝对现有设备的升级，直接以整机销售，为此购机成本较高。

停流型二维液相色谱，这种二维液相色谱的运行方式与环切换型在线二维液相色谱刚好相反，在进行第二维液相色谱分析的时候，其第一维液相色谱的流速为0，也就是处于停流状态，因此其第二维分析不受第一维分析限制，其第二维分析循环时间可以很长很长，因此这种色谱方式的分辨率极高，且具有更强的仪器兼容性，其对两个维度的液相色谱设备硬件要求较低，只要是台分析型液相色谱设备即可用于组装停流型二维液相色谱，为此，这种色谱模式很适用于实验室对现有老旧设备进行升级和改造，可以进一步实现物尽其用。这种色谱模式的缺点就是当第一维处在停流状态时，目标分析溶质可能存在一定的扩散，但通过最新研究发现，这种扩散仅在一定范围内，对分离效果影响不会太大，尤其对于大分子或者保留时间较长的分析而言，其扩散极低。这种色谱模式的另一种缺点在于其第一维洗脱过程不可见，因此存在一定的局限性，但是这种方式对于高精密分析型液相色谱设备而言，局限较小，仅需在分析前跑一次图谱即可知道大致的第一维分离情况。但整体而言，受到这两个缺点的影响，很多科研学者和使用者对此抱有一定的担心。

总结：

按分离能力排序：离线型二维液相色谱>停流型二维液相色谱>环切换型二维液相色谱；

按定量能力排序：停流型二维液相色谱=环切换型二维液相色谱>离线型二维液相色谱；

按定性能力排序：停流型二维液相色谱=环切换型二维液相色谱=离线型二维液相色谱；

按分离效率排序：环切换型二维液相色谱≥停流型二维液相色谱>离线型二维液相色谱；

按设备兼容性排序：离线型二维液相色谱>停流型二维液相色谱>环切换型二维液相色谱；

按购机和使用成本排序：离线型二维液相色谱>停流型二维液相色谱>环切换型二维液相色谱；

注：如采用自行构建、升级实验室仪器设备进行二维分析的方式，针对其二维液相色谱数据分析，色谱博士编辑部有自主开发的数据分析软件（以Matlab编译，可适用各类色谱设备产生的色谱数据），可供进行测试使用，欢迎咨询客服。

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