液相色谱仪器结构解析之一（色谱泵）

液相色谱根据其仪器性能和用途有很多分类和对应的名称，例如按照仪器性能和组成分类可大致分成：高效液相色谱（HPLC，耐压400 bar或6000 Psi）、超高效液相色谱（UHPLC，常为600 bar或9000 Psi）、超高压液相色谱（UPLC，常为1000 bar或15000 Psi左右）和超高效纳升级液相色谱（NanoLC，又称为毛细管液相色谱）；按照用途分类可分成反相液相色谱（RPLC、RSLC）、凝胶渗透色谱（SEC、GPC）、正向色谱（NPLC）、亲水作用色谱（HILIC）、离子色谱（HPIC）等等。然而万变不离其宗，其实这些液相色谱虽然名称和用途各异，但是其基本组成和结构基本一致，只是在不同应用条件下其硬件规格要求不同。以下我们重点讲述液相色谱仪器的具体组成。

液相色谱主要由4大模块组成：液相色谱泵（一）、进样器（二）、柱温箱（三）、检测器（四）。对于最近发展的二维液相色谱可在柱温箱上集成各类切换阀，但也有部分仪器采用阀切换系统单独外挂的形式使用（阀切换系统重点在二维液相色谱系统中讲述，目前色谱博士正开发适合各类液相色谱升级或安装的二维液相色谱阀切换系统）。

液相色谱仪器结构解析之一（色谱泵）

    液相色谱泵根据其溶剂通道数分为一元泵、二元泵、三元泵及四元泵，其中一元泵被称为单泵。二元泵常具备4个泵头对应两个输液单元（每两个泵头组成一对串联泵或并联泵，形成一个输液单元），其混合方式为两个输液单元分别吸取溶剂后在泵后色谱柱前高压混合，因此二元泵常被称为二元高压系统；三元泵和四元泵由于通道数较多，若每个通道使用一个输液单元则生产和使用成本太高，因此配备一个梯度混合器用于溶剂混合，混合后再由一个输液单元将液体输送至色谱柱进行分析，由于溶剂混合时压力较低，为此又被称为四元或三元低压泵。由于二元高压混合时，气体溶解度大，因此二元高压色谱泵输送溶剂时常不配备在线脱气机，而低压四元或三元泵在使用时则常配备在线脱气机，以脱除溶剂中残留的气体，避免泵腔中吸入空气造成空抽。

注：左图为Waters 600型的经典代表并联泵，右图为Ultimate 3000的经典代表串联泵（目前主流新机采用串联泵，如Agilent的1200系列色谱泵、Waters E2695、Acquity系列、赛默飞Ultimate系列等）；

并联泵的工作原理：暂未找到合适的动画，但是其工作原理大家可以大致想象为两个步调相反的正玄函数输出液体相叠加，是不是会两个曲线变一条直线？（不一定刚好完全是正玄，取决于并联泵的那个非圆齿轮）。

串联泵的工作原理可见视频：http://www.iqiyi.com/w_19rr7nfgq9.html；

两种泵无所谓哪个好哪个坏，因为技术在不断进步，科学总是向着高性价比的方向进行的，很显然，目前时代选择了串联泵，所以大家新买的仪器基本上也大部分都是串联泵了，但是了解一下会有助于理解泵的结构。

在仪器培训时，通常工程师会告诉使用人员溶剂使用前记得用超声脱气，这样会对基线稳定和测试有很大帮助。溶剂中若存在气体，轻则引起压力呈现规律性波动，重则积累在泵头柱塞杆处，引起柱塞杆在密封垫中干磨，严重缩短密封圈使用寿命。目前，由于技术进步较大，对于配备在线脱气机的色谱仪器如各类UPLC、安捷伦的1260HPLC、赛默飞的Ultimate 3000系列仪器等对溶剂脱气要求较低，笔者常直接拿配置的流动相直接上机进行分析，基本上压力波动不大。对于老机器，则对脱气要求较高。为了降低成本和简化仪器配置，目前大多数脱气机均内置于泵模块内（如waters、安捷伦液相等）或与溶剂托架合并（如赛默飞的液相）。

注：图为采用四元梯度的低压泵E2695的流路情况

梯度混合器主要为多个电磁阀，据经验估计，每个梯度混合器的造价与一个色谱泵头相当，梯度混合器工作时，每个通道由一个电磁阀控制流路的开启和关闭状态，通过主板控制各电磁阀的高速开启和关闭时间从而实现对各个通道溶剂的抽取比例控制，从而实现其色谱分析过程中的梯度分析。由于梯度混合后可能仍存在不均匀现象，为此目前多数机器仍在泵后加装了电磁混合器（即一个密闭的带有电磁混合的耐高压容器），对于二元高压泵，由于高压混合时可能不均匀，因此必须加装泵后混合器。另外，由于梯度混合器含有一定的死体积，且泵后混合亦有死体积，因此四元低压泵的死体积较大（400-700微升，根据仪器品牌和配置存在差异），其极少被用于超快速UPLC中。而二元高压色谱泵因其死体积极小最小可至65微升左右，因此其在UPLC中的应用非常广泛。小的延迟体积对于超快速UPLC分析，尤其是对于小颗粒短柱而言，对分析效果的重复性有着至关重要的作用。Tips：为了解决二元高压泵溶剂通道少，溶剂更换麻烦的问题，各大品牌常在泵前两个通道中每个通道加装一个切换阀，用于控制两个通道流路的切换，从而实现了4元通道，但实际使用时仍仅能2通道（如下图）。

注：处于离线工作状态的waters acquity H-Class 二元高压串联BSM泵（其四元是伪四元，并不是真正的四元）

色谱泵在使用过程中主要注意磷酸盐等有机相不可溶性盐类物质与非水相的过度，当使用完磷酸盐或非水相后，如果要过渡成非水相或磷酸盐溶液，中间一定要用水彻底冲洗色谱柱（一般冲洗体积为10倍柱体积，最少5倍柱体积），以放置盐类在电磁阀或泵腔内结晶析出损坏硬件。如果真的万一出现上述情况，首先应立即把流量关停，然后拆卸泵头，将泵头的密封垫、单向阀（又称止回阀）进行超声清洗，然后使用注射器对泵前管路抽取超纯水冲洗，若发现无法抽取水相通过电磁阀，可能是因为电磁阀堵了（比较少见），若推断电磁阀堵塞则想办法用注射器反相注入水相，然后再抽回，以此往复进行，若均行不通，则联系工程，千万不要将其拆卸下来放进超声机大功率超声清洗，极大可能损坏内部零件，切记切记！

此外，泵在运行过程中最好设置最低压力保护，笔者试过以前忘记设置最低压力保护，结果泵抽空了，柱塞杆还在不停的运转，这样很容易磨损密封垫，另外，当使用凝胶色谱柱时，切记一定要设置根据色谱柱耐压情况设置最高压力限制，放置出现意外情况导致色谱柱损坏。