液相色谱仪器结构解析之二（进样器）

液相色谱在食品、化工、医药等各行业、领域应用非常广泛，在前面的文章中，我们着重介绍了液相色谱的分类及其色谱泵（https://www.peposx.com/2018/04/25/液相色谱仪器结构解析之一（色谱泵）/），本文将继续介绍液相色谱仪的第二个重要部件————进样器。进样器在液相色谱中的主要作用正如其名，主要用于将待分析样品转入分析流路进行分析。目前进样器根据其自动化程度，主要分为手动进样器和自动进样器，由于现有仪器自动化程度以及批量检测的需要，手动进样器已非常少见于色谱仪器，但是就目前的色谱发展近况来看，手动进样器不会被完全淘汰，因为手动进样器几乎是很多前沿科技在研发过程中的必备用品，而且目前所有的色谱仪器和厂商均为其保留了最原始的接口。为了更好的理解手动/自动进样器的工作原理，我们着重介绍手动进样器。

一、手动进样器

目前为止，最为经典且应用最为广泛的手动进样器应属罗丹妮的7725i （i表示附带一个内嵌的侧向开关，可用于阀门转动时仪器的自动触发，若无i表示不带手动触发）手动进样器（详细信息请看IDEX美国官网）了，其阀门结构如下图一，7725i阀门为2槽2位6通阀门，它与很多阀门与众不同的地方在于它有6个位置，却只有2个流通槽，即图中深色部分阀门转子密封垫的连接部分，为流通槽，位于该槽两端的接口之间可以流通，而无槽部分则不能相通。在进样操作时，阀门应首先处于Load状态，然后通过进样注射器（注意一定要使用平头针微量注射器，使用尖头可能会在阀门转动过程中损坏转子）将样品经过针道注入定量环，待样品注入完成后，注意若需使用其内嵌的侧向开关实现自动触发进样（即在阀门进样转动瞬间仪器开始计时并运行仪器方法），在转动阀门之前，仪器应处于待触发状态（等待进样信号状态，Agilent、Thermo系列仪器无需特别设置其状态，Waters在单针进样时需手动设置状态，序列进样时，仪器可自动进入待触发状态），此时，迅速转动阀门至Inject位置，仪器根据进样器类型（带触发开关i的则自动立即开始计时，运行方法，若不带触发开关，则切记一定要立即移动鼠标点击进样或开始采集，否则保留时间将不准确），注意此时不能拔进样针，待进样后，冲洗一定时间（视流速和定量环大小，如100 ul定量环，1 mL/min流速，冲洗0.5 min相当于5倍定量环体积，可认为已将样品完全冲洗至色谱柱，并清洗干净定量待第二次进样），此时转动阀门至Load位置，在下次进样之前，用微量进样器吸取流动相彻底冲洗进样器和定量环，以免交叉污染。

之前介绍到7725i在手动标准色谱分析过程中使用非常广泛，那其过人之处在哪儿呢？不知道大家在家里接水龙头、水管这些多不多，有没有考虑过图一中上述阀门在阀门转动过程中，若无MBB流道，阀门将存在极短时间上的断流情况，该极短时间内，色谱泵的输液端被堵死，此时将造成极短时间的压力上升，若操作人员阀门转动速度较慢，将造成压力的急剧上升，所以为了解决该情况，罗丹妮阀门为其设计了不断流技术，即在流动相进液端（2号位）和出液端（3号位），在定子上挖了一条小沟，从而实现了其不断流，该技术因申请了国际专利保护，因此目前几乎没有第二家生产商可生产，为其行业地位打下了扎实的基础。下图为其MBB流道设计图。

图2 7725i阀门的MBB轴剖面示意图

针对其他手动进样器，有很多阀门设计可能不存在针道，同时其流通槽设计可能与上述7725i不同，目前大部分应用的进样阀为三槽二位六通阀，当这类手动阀门应用于进样时，可通过特殊的接头将阀门与微量注射器（如下图左上角处接头）连接起来，如下图3，其操作过程与7725i进样过程相同。注意手动进样器安装时，其废液管均需处于高位（超过进样位置，且若存在多条废液管，其管口应处于同一水平位置，如7725i进样阀）。

图3 三槽二位六通阀进样示意图（图片来自仪器信息网）

二、自动进样器

2.1 旁路进样

自动进样器的进样原理其实与手动进样器完全一致，只是采用电动替代了人工而已，相对而言，采用电动阀门其成本也大大提高，但其效率也提高了很多，目前市场价格大约电动六通阀的价格为手动阀门2-4倍左右（具体根据配置不同，其价格不同）。但随着自动进样器的发展，其进样模式出现了很多变化，主要体现在其进样流路的变化，目前根据进样方式，主要分为主路进样和旁路进样，之前我们所介绍的手动进样器其进样方式主要为旁路进样，进样针不处于液相色谱流路中，而是处于旁路位置，无论是在进样位置还是装载位置，进样针均不承受色谱流路的高压。旁路进样的进样如下图4，这种进样方式的好处就是进样针不承受来自色谱分析的压力，进样针内外清洗均可非常完全，较差污染小，但其显著缺点为这种方式进样量很大，因为需考虑到进样针那一部分的管路体积，通常样品吸取体积大于实际需要体积，在进行标准品分析时，非常耗费试剂量，此外，这种方式不利于进样器从多个瓶子中吸取样品、混匀等扩展操作。

图4 Waters 2707进样器旁路进样示意图（图片来自新浪爱问共享资料）

2.2 主路进样

目前Agilent、Dionex等公司均已淘汰上述旁路进样的方式，转而采用主路进样或主路与旁路进样相结合的方式。主路进样的方式如下图，进样针与样品环直接相连，成为定量环的一部分，进样针的针座与进样阀的连接位置与定量环和阀门的连接位置相邻，吸取样品时，进样阀转动至Load位置，进样针离开针座进行吸样操作，吸取完毕后，进样针回到针座，此时进样阀转动至Inject位置，流动相直接经过定量环、进样针、针座等流路，再将样品载入至色谱柱，也即在这个过程中进样针需要承受色谱分析流路的压力，在UPLC上，此压力更是高达1000 bar。这种进样方式的优点很明显，进样不需要内部清洗，因为整个进样针流路均经流动相持续清洗，进样体积完全等于实际吸样体积，样品尤其是标准品消耗量大大降低，此外，因为进样量等于实际进样量，为此，可在程序支持下进样柱前衍生操作，如多点进样（从多个瓶子先后吸取样品）、混合、反应等各类自定义操作（目前色谱博士实测Agilent、Dionex支持此项操作，Waters不支持）。这种主路进样存在的缺点主要是因为定量环持续至于流路中，导致梯度延迟体积增大，为此，部分厂商对此持续进行了改进，改进办法为主路进样与旁路进样相结合，即采用主路进样的方式吸取样品和进样，但在进样完成后，在保证样品被充分冲洗至色谱柱头后，将进样阀重新转回至Load位置，这样既可旁路进样针与定量环，从而大大减小了梯度延迟体积（实测Dionex、Waters支持此项操作）。

图5 主路进样示意图（图片源自Waters H-Class Acquity Console）

在下一篇文章中，我们将介绍当下液相色谱中的另一重要部件-柱温箱，柱温箱不仅仅起到恒温作用，其设计和使用更有大学问哦，欢迎关注我们。